真菌毒素對糧食飼料的污染是一個全球性的問題，我國因是農(nóng)業(yè)大國和人民以谷物為主食的飲食習(xí)慣，使真菌毒素的污染問題顯得更為突出。黃曲霉毒素是真菌毒素的重要代表之一，對世界上30多個國家和地區(qū)進(jìn)行的調(diào)查表明，危害程度排在第一位的是黃曲霉毒素。它是由黃曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的化合物[1]，均為二呋喃香豆素(difuranocoumarin)的衍生物。雖然黃典霉毒素(AF)的衍生物有20多種，目前已分離鑒定出的AF包括：AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFP1、AFQ、AFH1、AFGM、AFB2a和毒醇等12種，但天然污染糧油食品的AF是B組和G組兩大類，即AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。黃曲霉毒素的毒性，致突變及致癌作用已得到明確證實。它由強(qiáng)到弱的順序依次為AFB1> AFG1>AFM1>AFB2>AFG2[2]。 歐盟的黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)AFB1是4μg/kg。
霉菌毒素的檢測定量一直是個難點，目前黃曲霉毒素檢測的國標(biāo)方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、免疫親和柱凈化高效液相色譜法。薄層色譜法操作繁瑣、污染大、定量差、耗時長；而酶聯(lián)免疫法雖操作簡單、靈敏度高，但特異性差；免疫親和柱高效液相色譜法是柱后衍生法，它對于高黃曲霉毒素含量的樣品偏差較大。且柱后衍生不普及,給使用帶來不便。本文所述方法用真菌毒素多功能凈化柱快速凈化，高效液相柱前衍生法簡單方便，靈敏度和特異性高，又能避免氯仿等有毒試劑的使用,是一種值得推廣的好方法。這種方法，在國際上不少試驗室已得到確認(rèn)，還被作為AOAC的官方方法。
1 材料與方法
1.1 試劑和儀器
乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、疊氮化鈉(分析純)、去離子水、PuriToxSR160真菌毒素多功能凈化柱、高效液相色譜儀、2475熒光檢測器。
1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備
標(biāo)準(zhǔn)品包括了黃曲霉毒素B1、G1、B2、G2各單一標(biāo)準(zhǔn)液和混合標(biāo)準(zhǔn)液，溶劑為乙腈，黃曲霉素混合標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為2μg/ml B1、G1以及0.5μg/ml B2、G2。單一標(biāo)準(zhǔn)液用來確定各自的保留時間，具體工作用混合標(biāo)準(zhǔn)液是將所提供標(biāo)準(zhǔn)液稀釋10倍，用微量注射器分別取5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0μl稀釋標(biāo)準(zhǔn)液(具體濃度為200ng/ml的B1、G1；50ng/ml的B2、G2)，和樣品一樣蒸干，用三氟乙酸衍生，定容于0.2ml流動相，故所得進(jìn)針的濃度分別是：B1、G1為5.0、10.0、20.0、25.0、40.0、50.0ng/ml；G2、B2為1.25、2.5、5.0、6.25、10.0、12.5ng/ml。
1.3 樣品
實驗所用樣品包括玉米、小麥等，取代表樣品5kg，粉碎，充分混合均勻，四分法縮至500g。因霉菌毒素分布不均勻，充分混合非常重要，必要時取樣量加大(有地方建議取15kg)。
1.4 樣品的提取和凈化
使用粉碎機(jī)將樣品研細(xì)，稱取25g研細(xì)樣品置于250ml的燒瓶或攪拌瓶中。加入100ml乙腈-水(體積比84：16)溶液。在旋轉(zhuǎn)震蕩器上震蕩1h。用漏斗、定性濾紙將其過濾到樣品瓶中。轉(zhuǎn)移8ml樣品提取液通過PuriToxSR160真 菌毒素多功能凈化柱，推出大約4ml的凈化液(具體過程見圖1)，轉(zhuǎn)移2ml已凈化的提取液至潔凈的棕色瓶 。在水浴60℃條件下用氮?dú)獯蹈伞?/p>
1.5 柱前衍生及液相色譜條件
向剩余物中加入200μl正己烷、100μl三氟乙酸，立即旋緊蓋子。渦旋30s，在40℃烘箱中衍生15min，室溫下氮?dú)獯蹈苫旌衔?，?00μl水-乙腈(體積比85：15)溶解殘余物并渦旋30s，將其轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心試管中以10 000r/min的速度離心5min，把已經(jīng)制備凈化好的150μl樣品液轉(zhuǎn)移到HPLC樣品瓶，進(jìn)樣25μl。液相色譜條件見表1。
2 結(jié)果與討論
2.1 4種黃曲霉毒素的分離情況
取50μl黃曲霉毒素混標(biāo)工作溶液(濃度為B1、G1 200ng/ml；G2、B2 50ng/ml)于棕色瓶內(nèi)，吹干，衍生，流動相定容，經(jīng)液相色譜分離得出的標(biāo)準(zhǔn)色譜分離見圖2。黃曲霉毒素G1、B1的濃度為50ng/mlG2、B2的濃度為12.5ng/ml。
2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程
按實驗方法進(jìn)行測定，4種黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程及檢出限(按3倍信噪比計算)的測定結(jié)果見圖3和表2。
2.3 樣品的加標(biāo)回收實驗
取玉米樣品一份，分別做兩個濃度的加標(biāo)回收實驗。具體做法是：取8ml黃曲霉素空白樣的提取液,分別加10μl和 25μl黃曲霉素混合標(biāo)準(zhǔn)液(1 000ng/ml黃曲霉素B1、G1以及250ng/ml黃曲霉素B2、G2)作為加標(biāo)。經(jīng)過和樣品一樣的處理,得出其最后的理論濃度見下式。
①B1、G1濃度：(0.010ml×1 000ng/ml)/8ml×(2ml/0.2ml)=12.5ng/ml；
(0.025ml×1 000ng/ml)/8ml×(2ml/0.2ml)=31.25ng/ml。
②B2、G2濃渡：
(0.010ml×250ng/ml)/8ml×(2ml/0.2ml)=3.125ng/ml；
(0.025ml×250ng/ml)/8ml×(2ml/0.2ml)=7.812 5ng/ml。
2.4 精密度實驗
按實驗方法進(jìn)行樣品處理，對同一樣品連續(xù)測定5次。
2.5 樣品調(diào)查
從市面上抽取10份玉米樣品,按此實驗方法進(jìn)行處理，結(jié)果為未檢出黃曲霉毒素。此方法簡便易行、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、檢測限低，適合大批量檢測，值得推廣