熒光法硫胺素（維生素B1）的測定方法

1．原理
硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外線下，噻嘧色素發(fā)出熒光。在給定的條件下，以及沒有其他熒光物質(zhì)干擾時，此熒光之強度與噻嘧色素量成正比，即與溶液中硫胺素量成正比。
如樣品中含雜質(zhì)過多，應(yīng)經(jīng)過離子交換劑處理，使硫胺素與雜質(zhì)分離，然后以所得溶液作測定。
本方法的最小檢出限為0.05μg。
2．適用范圍
GB12390-90 本方法適用于各類食物中硫胺素的測定，但不適用于有吸附硫胺素能力的物質(zhì)和含有影響噻嘧色素?zé)晒馕镔|(zhì)的樣品。
3．儀器
3.1電熱恒溫培養(yǎng)箱
3.2熒光分光光度計
4． 試劑
本實驗用水均為蒸餾水，試劑不加說明均為分析純試劑
4.1 正丁醇：分析純需經(jīng)重蒸餾后使用。
4.2 無水硫酸鈉：Na2SO4。
4.3 淀粉酶和蛋白酶：國產(chǎn)或進口均可。
4.4 0.1mol/L鹽酸：8.5ml濃鹽酸（比重1.19或1.20）用水稀釋至1000ml。
4.5 0.3mol/L鹽酸：25.5ml濃鹽酸用水稀釋至1000ml。
4.6 2mol/L乙酸鈉溶液：164g無水乙酸鈉溶于水中稀釋至1000ml。
4.7 25%氯化鉀溶液：250g氯化鉀溶于水中稀釋至1000ml。
4.8 25%酸性氯化鉀溶液：8.5ml濃鹽酸用25%氯化鉀溶液稀釋至1000ml。
4.9 15%氫氧化鈉溶液：15g氫氧化鈉溶于水中稀釋至100ml。
4.10 1%鐵氰化鉀溶液：1g鐵氰化鉀溶于水中稀釋至100ml，放于棕色瓶內(nèi)保存。
4.11 堿性鐵氰化鉀溶液：取4ml1%鐵氰化鉀溶液，用15%氫氧化鈉溶液稀釋至60ml。用時現(xiàn)配，避光使用。
4.12 3%乙酸溶液：30ml冰乙酸用水稀釋至1000ml。
4.13 活性人造浮石：稱取200g40~60目的人造浮石，以10倍于其容積的3%熱乙酸溶液攪洗2次，每次10min；再用5倍于其容積的25%熱氯化鉀溶液攪洗15min；然后再用3%熱乙酸溶液攪洗10min；最后用熱蒸餾水洗至沒有氯離子。于蒸餾水中保存。
4.14 0.04%溴甲酚綠溶液：稱取0.1g溴甲酚綠，置于小研缽中，加入1.4mL0.1mol/L氫氧化鈉研磨片刻，再加入少許水繼續(xù)研磨至完全溶解，用水稀釋至250mL。
4.15 標(biāo)準(zhǔn)
4.15.1 硫胺素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（0.1mg/ml）：準(zhǔn)確稱取100mg經(jīng)氯化鈣干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L鹽酸中，并稀釋至1000ml。于冰箱中避光保存。
4.15.2 硫胺素標(biāo)準(zhǔn)中間液（10μg/ml）：將硫胺素標(biāo)準(zhǔn)貯備液用0.01mol/L鹽酸稀釋10倍，于冰箱中避光保存。
4.15.3 硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.1μg/ml）：將硫胺素標(biāo)準(zhǔn)中間液用水稀釋100倍，用時現(xiàn)配。
5.操作步驟
5.1 樣品制備
樣品采集后用勻漿機打成勻漿于低溫冰箱中冷凍保存，用時將其解凍后混勻使用。干燥樣品要將其盡量粉碎后備用。
5.2 提取
5.2.1精確稱取一定量試樣（估計其硫胺素含量約為10~30μg，一般稱取2~10g試樣），置于100ml三角瓶中，加入50ml 0.1mol/L或0.3mol/L鹽酸使其溶解，放入高壓鍋中加熱水解121℃30min，涼后取出。
5.2.2 用2mol/L乙酸鈉調(diào)其pH值為4.5（以0.04%溴甲酚綠為外指示劑）。
5.2.3 按每克樣品加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45~50℃溫箱過夜保溫（約16h）。
5.2.4 涼至室溫，定容至100ml，然后混勻過濾，即為提取液。
5.3 凈化
5.3.1用少許脫脂棉鋪于鹽基交換管的交換柱底部，加水將棉纖維中氣泡排出，再加約1g活性人造浮石使之達(dá)到交換柱的三分之一高度。保持鹽基交換管中液面始終高于活性人造浮石。
5.3.2 用移液管加入提取液20~60ml（使通過活性人造浮石的硫胺素總量約為2~5μg）。
5.3.3 加入約10ml熱蒸餾水沖洗交換柱，棄去洗液。如此重復(fù)三次。
5.3.4 加入25%酸性氯化鉀（溫度為90℃左右）20ml，收集此液于25ml刻度試管內(nèi)，涼至室溫，用25%酸性氯化鉀定容至25ml，即為樣品凈化液。
5.3.5 重復(fù)上述操作，將20ml硫胺素標(biāo)準(zhǔn)使用液加入鹽基交換管以代替樣品提取液，即得到標(biāo)準(zhǔn)凈化液。
5.4 氧化
5.4.1 將5ml樣品凈化液分別加入A、B兩個反應(yīng)瓶。
5.4.2 在避光條件下將3ml 15%氫氧化鈉加入反應(yīng)瓶A，將3ml堿性鐵氰化鉀溶液加入反應(yīng)瓶B，振搖約15s，然后加入10ml正丁醇；將A、B兩個反應(yīng)瓶同時用力振搖1.5min。
5.4.3 重復(fù)上述操作，用標(biāo)準(zhǔn)凈化液代替樣品凈化液。
5.4.4 靜置分層后吸去下層堿性溶液，加入2~3g無水硫酸鈉使溶液脫水。
5.5 測定
5.5.1熒光測定條件：
激發(fā)波長365nm；發(fā)射波長435nm；激發(fā)波狹縫5nm；發(fā)射波狹縫5nm。
5.5.2依次測定下列熒光強度：
a. 樣品空白熒光強度（樣品反應(yīng)瓶A）；
b. 標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強度（標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)瓶A）；
c. 樣品熒光強度（樣品反應(yīng)瓶B）；
d. 標(biāo)準(zhǔn)熒光強度（標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)瓶B）；
6.計算
              c·V V1 1 100
X=（U－Ub）×────×──×──×───
              （S－Sb） V2 m 1000
式中：X──樣品中硫胺素含量，mg/100g；
U──樣品熒光強度；
Ub──樣品空白熒光強度；
S──標(biāo)準(zhǔn)熒光強度；
Sb──標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強度；
c──硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，μg/ml；
V──用于凈化的硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液體積，ml；
V1──樣品水解后定容之體積，ml；
V2──樣品用于凈化的提取液體積，ml；
m──樣品質(zhì)量，g；
100
── ──樣品含量由μg/g換算成mg/100g的系數(shù)。
1000
例：麩皮2.019g，共有提取液100ml，取20ml經(jīng)鹽基交換管過濾，得提純液25ml。取5ml提純液做測定，得出如下結(jié)果：
U=52.81 S=45.83 Ub=3.795 Sb=2.692
                0.1×20 100 1 100
（52.81－3.795）×------×--×--×--- = 0.56 mg/100g
               （45.83－2.692） 20 2.019 1000

7.注意事項
7.1加熱酸性氯化鉀而不使其沸的原因是熱氯化鉀濾速較快，而不沸則是使其不至因過飽和而在洗滌中結(jié)晶析出阻塞交換柱。被洗下的硫胺素在酸性氯化鉀中極其穩(wěn)定，可保存一周以上。
7.2硫胺素在堿性環(huán)境中被鐵氰化鉀氧化成噻嘧色素，振搖15s是使其充分反應(yīng)，這期間應(yīng)保證黃色不退證明鐵氰化鉀量充足不被其它還原性雜質(zhì)耗盡，而強堿又可破壞硫胺素，所以除加入堿性鐵氰化鉀時邊搖勻邊加入外，其加入量一定不能過多，否則硫胺素被破壞。
7.3步驟5.4.2是整個實驗的關(guān)鍵，對每個樣品所加試劑的次序、快慢、振搖時間等都必須盡量一致，尤其是用正丁醇提取噻嘧色素時必須保證準(zhǔn)確振搖90s。