抗壞血酸（維生素C）的測定方法
在測定維生素C的國標(biāo)方法中，熒光法為測定食物中維生素C含量的第一標(biāo)準(zhǔn)方法，2、4－二硝基苯肼法作為第二法。

一、熒光法
1．原理
樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化成脫氫型抗壞血酸后，與鄰苯二胺（OPDA）反應(yīng)生成具有熒光的喹喔啉（quinoxaline）,其熒光強(qiáng)度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比，以此測定食物中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。
脫氫抗壞血酸與硼酸可形成復(fù)合物而不與OPDA反應(yīng)，以此排除樣品中熒光雜質(zhì)所產(chǎn)生的干擾。本方法的最小檢出限為0.022g/ml。
2．適用范圍
GB12392-90 本方法適用于蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定
3．儀器
3．1．實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。
3．2．熒光分光光度計(jì)或具有350nm及430nm波長的熒光計(jì)。
3．3．打碎機(jī)。
4．試劑
本實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水，試劑不加說明均為分析純試劑。
（1）偏磷酸－乙酸液：稱取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，攪拌，放置過夜使之逐漸溶解，加水至500ml。4℃冰箱可保存7～10天。
（2）0.15 mol/L硫酸：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀釋至1200ml。
（3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L硫酸液為稀釋液，其余同4.1.配制。
（4）50％ 乙酸鈉溶液：稱取500g乙酸鈉（CH3COONa·3H2O），加水至1000ml。
（5）硼酸-乙酸鈉溶液：稱取3g硼酸，溶于100ml乙酸鈉溶液（4.4）中。臨用前配制。
（6） 鄰苯二胺溶液：稱取20mg鄰苯二胺，于臨用前用水稀釋至100ml。
（7）0.04%百里酚藍(lán)指示劑溶液：稱取0.1g百里酚藍(lán)，加0.02mol/L氫氧化鈉溶液，在玻璃研缽中研磨至溶解，氫氧化鈉的用量約為10.75ml，磨溶后用水稀釋至250ml。
變色范圍：pH=1.2 紅色
pH=2.8 黃色
pH＞4.0 蘭色
（8）活性炭的活化：加200g炭粉于1L1+9鹽酸中，加熱回流1~2h，過濾，用水洗至濾液中無鐵離子為止，置于110~120℃烘箱中干燥，備用。

（9）標(biāo)準(zhǔn)
抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg/ml）：準(zhǔn)確稱取50mg抗壞血酸，用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中，并稀釋至刻度。
抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用液（100μg/ml）:取10ml抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100ml。定容前試pH值，如其pH＞2.2時(shí)，則應(yīng)用溶液（4.3）稀釋。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取下述"標(biāo)準(zhǔn)"溶液（抗壞血酸含量10μg/ml）0.5、1.0、1.5和2.0ml標(biāo)準(zhǔn)系列，取雙份分別置于10ml帶蓋試管中，再用水補(bǔ)充至2.0ml。
5.操作步驟
5.1 樣品制備
全部實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)避光。
稱取100g鮮樣，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎機(jī)內(nèi)打成勻漿，用百里酚藍(lán)指示劑調(diào)試勻漿酸堿度。如呈紅色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀釋，若呈黃色或蘭色，則用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀釋，使其pH為1.2。勻漿的取量需根據(jù)樣品中抗壞血酸的含量而定。當(dāng)樣品液含量在40~100μg/ml之間，一般取20g勻漿，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100ml，過濾，濾液備用。

5.2氧化處理：分別取樣品濾液及標(biāo)準(zhǔn)使用液各100ml于帶蓋三角瓶中，加2g活性炭，用力振搖1min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液，分別收集其余全部濾液，即樣品氧化液和標(biāo)準(zhǔn)氧化液，待測定。
5.3 各取5ml標(biāo)準(zhǔn)氧化液于2個(gè)50ml容量瓶中，分別標(biāo)明"標(biāo)準(zhǔn)"及"標(biāo)準(zhǔn)空白"。
5.4 各取5ml樣品氧化液于2個(gè)50ml容量瓶中，分別標(biāo)明"樣品"及"樣品空白"。
5.5于"標(biāo)準(zhǔn)空白"及"樣品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸鈉溶液，混合搖動15min，用水稀釋至50ml，在4℃冰箱中放置2h，取出備用。
5.6 于"樣品"及"標(biāo)準(zhǔn)"溶液中各加入5ml50%乙酸鈉溶液，用水稀釋至50ml，備用。
5.7 熒光反應(yīng)
取"標(biāo)準(zhǔn)空白"溶液，"樣品空白"溶液及（5.6）中"樣品"溶液各2ml，分別置于10ml帶蓋試管中。在暗室中迅速向各管中加入5ml鄰苯二胺，振搖混合，在室溫下反應(yīng)35min，用激發(fā)光波長338nm、發(fā)射光波長420nm測定熒光強(qiáng)度。標(biāo)準(zhǔn)系列熒光強(qiáng)度分別減去標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的抗壞血酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，其直線回歸方程供計(jì)算時(shí)使用。
6. 計(jì)算
X=（c×V/m）×F×(100/1000)
式中：X-----樣品中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸總含量，mg/100g；
c------由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得或由回歸方程算得樣品溶液濃度，μg/ml；
m-----試樣質(zhì)量，g；
F------樣品溶液的稀釋倍數(shù)；
V------熒光反應(yīng)所用試樣體積，ml。
例：測定每一制備溶液的熒光強(qiáng)度。用標(biāo)準(zhǔn)溶液每ml含2.5μg、5.0μg、7.5μg及10.0μg，各標(biāo)準(zhǔn)濃度管讀數(shù)減去相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)空白讀數(shù)的各平均值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
由樣品液讀數(shù)減去樣品液空白讀數(shù)之值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的抗壞血酸（μg/ml），按取樣量及稀釋率計(jì)算樣品中抗壞血酸的含量。
如：取制備好的辣椒樣品2.138g，稀釋到100ml，氧化后分別取10ml濾液稀釋到50ml
樣品讀數(shù)為23.34，樣品空白讀數(shù)為3.188，樣品讀數(shù)減去樣品空白讀數(shù)為20.152，查熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸的2.23μg。

2.23×100 50 100
-----×-×-- = 52（mg/100g）
2.138 10 1000

7.注意事項(xiàng)
7.1大多數(shù)植物組織內(nèi)含有一種能破壞抗壞血酸的氧化酶，因此，抗壞血酸的測定應(yīng)采用新鮮樣品并盡快用偏磷酸-醋酸提取液將樣品制成勻漿以保存維生素C。
7.2 某些果膠含量高的樣品不易過濾，可采用抽濾的方法，也可先離心，再取上清液過濾。
7.3活性炭可將抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸，但它也有吸附抗壞血酸的作用，故活性炭用量應(yīng)適當(dāng)與準(zhǔn)確，所以，應(yīng)用天平稱量。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，用2g活性炭能使測定樣品中還原型抗壞血酸完全氧化為脫氫型，其吸附影響不明顯。

二、2，4-二硝基苯肼法
1．原理
總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸。樣品中還原型抗壞血酸經(jīng)活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4-二硝基苯肼作用生成紅色脎，脎的含量與總抗壞血酸含量成正比，進(jìn)行比色測定。
2．適用范圍
GB12392-90 本方法適用于蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定。
3. 儀器
3.1恒溫箱：37±0.5℃
3.2可見-紫外分光光度計(jì)
3.3打碎機(jī)
4．試劑
本實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水，試劑純度均為分析純。
4.1 4.5mol/L硫酸：謹(jǐn)慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中，冷卻后用水稀釋至1000ml。
4.2 85%硫酸：謹(jǐn)慎地加900ml硫酸（比重1.84）于100ml水中。
4.32%2，4-二硝基苯肼溶液：溶解2g2，4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸內(nèi)，過濾。不用時(shí)存于冰箱內(nèi)，每次用前必須過濾。
4.4 2%草酸溶液：溶解20g草酸于700ml水中，稀釋至1000ml。
4.5 1%草酸溶液：稀釋500ml 2%草酸溶液到1000ml。
4.6 1%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500ml 1%草酸溶液中。
4.7 2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。
4.8 1mol/L鹽酸：取100ml鹽酸，加入水中，并稀釋至1200ml。
4.9活性炭：將100g活性炭加到750ml1mol/L鹽酸中，回流1~2h，過濾，用水洗數(shù)次，至濾液中無鐵離子（Fe3+）為止，然后置于110℃烘箱中烘干。
4.10 標(biāo)準(zhǔn)
（1）抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg/ml）：溶解100mg純抗壞血酸于100ml 1%草酸溶液中。
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
加1g活性炭于50ml標(biāo)準(zhǔn)溶液中，搖動1min，過濾。
取10ml濾液放入500ml容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀釋至刻度?？箟难釢舛葹?0μg/ml。
取5，10，20，25，40，50，60ml稀釋液，分別放入7個(gè)100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀釋至刻度，使最后稀釋液中抗壞血酸的濃度分別為1，2，4，5，8，10及12μg/ml。
按樣品測定步驟形成脎并比色。
以吸光值為縱坐標(biāo)，以抗壞血酸濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5. 操作步驟
5.1樣品制備
全部實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)避光。
5.1.1鮮樣制備：稱100g鮮樣和100g2%草酸溶液，倒入打碎機(jī)中打成勻漿，取10-40g勻漿（含1-2mg抗壞血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。
5.1.2干樣制備：稱1-4g干樣（含1-2mg抗壞血酸）放入乳缽內(nèi)，加入1%草酸溶液磨成勻漿，倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。
5.1.3將上述兩液過濾，濾液備用。不易過濾的樣品可用離心機(jī)沉淀后，傾出上清液，過濾，備用。
5.2氧化處理：取25ml上述濾液，加入0.5g活性炭，振搖1min，過濾，棄去最初數(shù)毫升濾液。取10ml此氧化提取液，加入10ml2%硫脲溶液，混勻。
5.3呈色反應(yīng)
5.3.1于三個(gè)試管中各加入4ml稀釋液。一個(gè)試管作為空白，在其余試管中加入1.0ml2%2，4-二硝基苯肼溶液，將所有試管放入37±0.5℃恒溫箱或水浴中，保溫3h。
5.3.23h后取出，除空白管外，將所有試管放入冰水中?？瞻坠苋〕龊笫蛊淅涞绞覝?，然后加入1.0ml2%2，4-二硝基苯肼溶液，在室溫中放置10~15min后放入冰水內(nèi)。其余步驟同樣品。
5.3.385%硫酸處理：當(dāng)試管放入冰水后，向每一試管中加入5ml85%硫酸，滴加時(shí)間至少需要1min，需邊加邊搖動試管。將試管自冰水中取出，在室溫放置30min后比色。
5.3.4 比色：用1cm比色杯，以空白液調(diào)零點(diǎn)，于500nm波長測吸光值。
6. 計(jì)算
同熒光法。
7. 注意事項(xiàng)
7.1大多數(shù)植物組織內(nèi)含有一種能破壞抗壞血酸的氧化酶，因此，抗壞血酸的測定應(yīng)采用新鮮樣品并盡快用2%草酸溶液制成勻漿以保存維生素C。
7.2 若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解熱會使溶液變黑。
7.3 試管自冰水中取出后，顏色會繼續(xù)變深，所以，加入硫酸后30分鐘應(yīng)準(zhǔn)時(shí)比色。