尼克酸（維生素PP，又稱煙酸）的測定方法
此處介紹微生物法、比色法以及復(fù)合維生素制劑中的煙酰胺測定方法（分光光度法）
一、微生物法
1.原理
一種微生物生長必需某一些維生素，Lactobacillusarabinosus的生長需要尼克酸。尼克酸是指具有尼克酸生物學(xué)活性的吡啶3-羧酸及其衍生物的總稱。它是白色晶體，是維生素中最穩(wěn)定的一種，對酸、堿、熱、光及弱氧化劑都很穩(wěn)定，微溶于冷水，易溶于熱水及乙醇。其檢出限為10ng。
2.適用范圍
本方法來源自AOAC和國標(biāo)GB12395-90。適用于食物及飼料中的尼克酸的檢測。
3.儀器
（1） 電熱恒溫培養(yǎng)箱(37±0.5℃)
（2） 無菌室（紫外燈消毒）
（3） 電熱手提式壓力蒸汽消毒器（121℃，高壓30min）
（4） 液體快速混合器
（5） 離心機(jī)（3000轉(zhuǎn)，10min）
（6） 堿式滴定管
（7） 硬質(zhì)玻璃試管
4.試劑
所用試劑皆為分析純；所用水皆為蒸餾水
4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
（1）尼克酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（0.1mg/ml）：準(zhǔn)確稱取50.0mg已干燥恒重并儲于五氧化二磷干燥器中的尼克酸標(biāo)準(zhǔn)，以25%乙醇溶液溶解并定容至500ml，于冰箱中保存。
（2）尼克酸標(biāo)準(zhǔn)中間液（1ug/m）：吸取1.00ml尼克酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于100ml容量瓶中，用25%乙醇溶液定容，混勻，于冰箱中保存。
（3） 尼克酸標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.1ug/m）：臨用時吸取5.00ml尼克酸標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于50ml容量瓶中，用水定容，混勻。
4.2 其它試劑的配制
（1） 0.5mol/L硫酸：于2000ml燒杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀釋至1000ml。
（2） 10mol/L氫氧化鈉：溶200g NaOH于水中，稀釋至500ml。
（3） 0.1mol/L氫氧化鈉：，取10ml 10mol/L NaOH，用水稀釋至1000ml。
（4） 0.04%溴甲酚綠溶液，稱取0.1g溴甲酚綠于研缽中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋到250ml。
（5）酪蛋白（sigma公司）：稱取50g不含維生素的酪蛋白，加200ml（3mol/L）鹽酸，121℃磅壓力下水解6小時，將水解物轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，在水浴上蒸發(fā)至膏狀。加200ml水使之溶解后再蒸發(fā)至膏狀，反復(fù)3次，以除去鹽酸。
注意：*酸解酪蛋白是為了去除酪蛋白中的維生素，確保培養(yǎng)基中不含代測的尼克酸，但酸解并不一定徹底，因此選用不含維生素的酪蛋白。
*水浴蒸發(fā)時不可蒸干或使之焦糊，若溶液被蒸干，水解液所含營養(yǎng)物已被破壞
用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至3.5，以溴酚藍(lán)作外指示劑。加20g活性炭，振搖，過濾，反復(fù)操作至濾液無色。濾液加水稀釋至500ml，加少許甲苯置冰箱中保存。
*注意：活性炭不能在溶液中太久，否則容易破壞酪蛋白的營養(yǎng)成分
（6） 溴酚藍(lán)：稱取0.1g溴酚藍(lán)，用1+4乙醇溶解后，再加乙醇稀釋至100ml。
（7） 甲苯
（8） 4mol/L鹽酸溶液，V+V=1+4
（9） 5mol/L生理鹽水：取9gNaCl溶于1000ml水中。
（10）胱氨酸、色氨酸溶液：稱取4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸溶于800ml水中，加熱至70～80℃，逐滴加入20%鹽酸，不斷攪拌，直至完全溶解為止。冷至室溫，加水稀釋至1000ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
（11）腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液：稱取硫酸腺嘌呤，鹽酸鳥嘌呤及尿嘧啶各0.1g，加75ml水和2ml濃鹽酸，然后加熱使其完全溶解，冷卻，若有沉淀產(chǎn)生，加濃鹽酸數(shù)滴，再加熱。如此反復(fù)，直至冷卻后無沉淀產(chǎn)生為止。用水稀釋至100ml。加少許甲苯于冰箱中保存。
（12）D-泛酸鈣、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆醇溶液：稱取D-泛酸鈣、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆醇各10mg于燒杯中，以水溶解并稀釋至1000ml，將此液置于棕色瓶中，加少許甲苯于冰箱中保存。
*注意：此溶液見光分解，因此儲存于棕色瓶中
（13） 0.02mol/L醋酸溶液：取1.18ml純的冰醋酸，稀釋至1000ml
（14）核黃素、鹽酸硫胺素、生物素溶液：溶解1mg生物素結(jié)晶于100ml0.01747mol/L的醋酸中，取此液4ml（相當(dāng)于40ug生物素），加入20mg核黃素和10mg鹽酸硫胺素，以0.01747mol/L醋酸溶解并稀釋至1000ml，將此液置于棕色瓶中，加少許甲苯于冰箱中保存。
*注意：此溶液見光分解，因此儲存于棕色瓶中
（15） 甲鹽溶液：取25g磷酸氫二鉀和25g磷酸二氫鉀，加水溶解后稀釋至500ml，加少許甲苯于冰箱中保存。
（16）乙鹽溶液：取10g硫酸鎂、0.5g氯化鈉、0.5g硫酸亞鐵和0.5g硫酸錳，加水溶解后稀釋至500ml，加5滴濃鹽酸，加少許甲苯于冰箱中保存。
（17） 乙醇溶液 V/V=1/3
（18） 溴酚藍(lán)：稱取0.1g溴酚藍(lán)，用1+3乙醇溶液溶解后，再稀釋至100ml。
（19）0.04%溴麝香草酚藍(lán)溶液：稱取0.1g溴麝香草酚藍(lán)于研缽中，加1.6ml，0.1mol/LNaOH，研磨，加少許水繼續(xù)研磨，直至完全溶解，用水稀釋至250ml。
（20） 0.004%溴麝香草酚藍(lán)溶液：量取100ml0.04%溴麝香草酚藍(lán)溶液，加水稀釋至1000ml，供滴定用。
（21） 基本培養(yǎng)基儲備液：
酸解酪蛋白 50ml
胱氨酸、色氨酸溶液 50ml
腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶溶液 10ml
D-泛酸鈣、對氨基苯甲酸、吡哆醇溶液 10ml
核黃素、鹽酸硫胺素、生物素溶液 10ml
甲鹽溶液 10ml
乙鹽溶液 10ml
無水葡萄糖 10g
無水醋酸鈉 10g
（或結(jié)晶醋酸鈉NaAC.3H2O 16.6g）
將上列試劑混合，用水稀釋至500ml用氫氧化鈉調(diào)PH至6.8，以溴麝香草酚藍(lán)作外指示劑。
（22） 瓊脂培養(yǎng)基：
無水葡萄糖 1g
醋酸鈉 1g
蛋白胨 0.8g
酵母提取物干粉 0.2g
甲鹽溶液 0.2ml
乙鹽溶液 0.2ml
瓊脂 1.2g
混合，加水至100ml，加熱至瓊脂完全溶化，以溴麝香草酚藍(lán)為外指示劑，用鹽酸趁熱調(diào)PH至6.8，盡快倒入試管中，每管3～5ml，加塞棉塞，于壓力蒸汽消毒器中121℃滅菌10min，取出后豎直試管，冷至室溫后保存于冰箱中。
4.3菌種的制備與保存
（1） 菌種的制備與保存：以阿拉伯乳酸桿菌?Lactobacillus arabinosus 17-5 ATCC No.8014簡稱Lact.A?純菌種接入2個或多個瓊脂培養(yǎng)基管中，在37±0.5℃恒溫箱中保溫16-24小時，取出于冰箱中保存，至多不超過兩周。保存數(shù)周以上的菌種，不能立即用作制備接種液之用，一定要在使用前每天轉(zhuǎn)種一次，連續(xù)2-3天，方可使用，否則生長不好。
（2） 種子培養(yǎng)液的制備：加5ml0.1ug/ml的尼克酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液于尖頭試管中，加入5ml基本培養(yǎng)基，塞好棉塞，于壓力蒸汽消毒器內(nèi)（高壓鍋）121℃下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保存數(shù)周之久。
5.操作步驟
5.1樣品制備：取含尼克酸約5-50ug的均勻樣品于100ml三角瓶中，加0.5mol/LH2SO450ml。放入高壓蒸汽鍋121℃下水解30min，取出，于水中冷卻，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4調(diào)PH值至4.5，用溴甲酚綠做指示劑。將三角瓶內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至100ml，濾紙過濾，保存濾液于冰箱內(nèi)備測（保存期不超過36小時）。
*用0.5mol/L硫酸水解，可以斷開尼克酸和其它物質(zhì)結(jié)合的鍵，使尼克酸游離出來。
*觀察溴甲酚綠至草綠色為終點(diǎn)，說明溶液PH值到了4.5.調(diào)PH值至4.5可以除去樣品中刺激和抑制細(xì)菌生長的物質(zhì)，如：淀粉、脂肪酸及磷脂。許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)也在PH4.5，所以此PH值也可用來沉淀蛋白質(zhì)。
5.2接種液的制備：使用前一天，將阿拉伯乳酸桿菌菌種由儲備菌種管移種于已消毒的種子培養(yǎng)液中，可同時制備兩管，在37±0.5℃的恒溫箱中培養(yǎng)16-24小時。取出離心10分鐘（3000rpm）傾去上部液體，用已消毒的生理鹽水淋洗2次，再加10ml消毒過的生理鹽水，將離心管置于液體快速混合器上混合，使菌種成為混懸體，將此液倒入已消毒的注射器內(nèi)，立即使用。
5.3樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：3組試管各加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0ml工作液，每管加水稀釋至5ml，再加5ml基本培養(yǎng)基，混勻，加棉塞。
5.4試樣的測定：在試管中分別加入1，2，3，4ml樣液，加水稀釋至5ml，再加入5ml基本培養(yǎng)基，用棉塞塞住試管，將制備好的標(biāo)準(zhǔn)曲線和試樣測定管放入高壓鍋（121℃）高壓10min，冷至室溫備用。
5.5接種和培養(yǎng)：每管種一滴接種液，于37±0.5℃恒溫箱中培養(yǎng)72小時
*注意：接種后用振蕩器振蕩混勻試管中的液體。
5.6滴定：從恒溫箱中取出后，將試管中培養(yǎng)液倒入50ml三角瓶中，用5ml0.004%溴麝香草酚藍(lán)分二次淋洗試管，洗液倒入該三角瓶中，以0.1mol/L氫氧化鈉溶液滴定，呈綠色即為終點(diǎn)，此時PH約6.8，繪制尼克酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用測定管得到的值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到測定管內(nèi)所含尼克酸的量。
* 水解液的PH值調(diào)至6.8是為了不同的試劑加入基本培養(yǎng)基時，不致改變基本培養(yǎng)基的PH值。（此乳酸菌生長的適宜PH值為6.8）
6.計(jì)算
以尼克酸標(biāo)準(zhǔn)系列的不同微克數(shù)為橫坐標(biāo)，滴定所需0.1mol/L氫氧化鈉 毫升數(shù)為縱坐標(biāo)，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
X=（C×V/m）×F×（100/1000）
X--樣品中尼克酸的含量，mg/100g；
C--每毫升樣品中尼克酸含量的平均值，ug/ml；
V--樣品水解液定容總體積，ml；
F--樣品試液的稀釋倍數(shù)；
m--試樣質(zhì)量，g；
100/1000--折算成每100g樣品中尼克酸含量，mg。
7.舉例
取一螺旋藻樣品1.004g（m），處理后定容為100ml（V），從中取1ml稀釋至25ml（F），取1，2，3，4ml入試管中，加入水和培養(yǎng)基，高壓消毒，培養(yǎng)，滴定，測量根據(jù)曲線分別得出四管C值為0.037，0.073，0.110，0.136，所以四管平均值為C=（0.037+0.073/2+0.110/3+0.136/4）/4=0.036。代入方程式為：
X=（C×V/m）×F×（100/1000）=（0.036×100/1.004）×25×（100/1000）=8.96（mg/100g）
因此得出每100克螺旋藻中含8.96毫克尼克酸。
8.注意事項(xiàng)
（1） 當(dāng)管中尼克酸的量少于0.05或多于0.3ug，即超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍時所得到的數(shù)值不能用于計(jì)算。
（2） 3mol/L鹽酸的配制方法：取250ml濃鹽酸，加入750ml蒸餾水，共配成1L 3mol/L的鹽酸
（3）試管應(yīng)先用洗衣粉清洗后，用水沖凈，再放入酸缸中浸泡1天左右，撈出后再用自來水和蒸餾水清洗干凈，涼干，方可再用。

二、比色法
1.原理
煙酸和煙酰胺于Ph=4.5下用稀NH4OH提取，再與CNBr溶液與10％對氨基苯磺酸反應(yīng)，測其比色值。
2.適用范圍
選自AOAC；適用范圍：適用于藥物、食物和飼料
3.儀器設(shè)備
（1） 容量瓶，100ml
（2） 錐形瓶，250ml
（3） 電熱板
（4） 高壓釜（121℃，30min）
（5） 離心管，5ml
（6） 漏斗
（7） 通風(fēng)櫥
（8） 酸式滴定管
比色計(jì)（藥物430-450nm，谷物470nm）
4.試劑
所用試劑皆為分析純；所用水皆為蒸餾水
4.1尼克酸標(biāo)準(zhǔn)溶液
（1） 尼克酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100μg/ml）：將50mgUSP煙道參比標(biāo)準(zhǔn)（貯于P2O5干燥器中，放于暗處保存。）
（2） 標(biāo)準(zhǔn)中間液Ι（10μg/ml）：取少量貯備液放置至室溫。用蒸餾水將10.0ml貯備液稀釋至100ml。
（3） 標(biāo)準(zhǔn)工作液Π（4μg/ml）：將恢復(fù)至室溫的貯備液2.0ml用蒸餾水稀釋至50ml。
4.2其它試劑
（1） 稀氫氧化銨溶液：5mlNH4OH用H2O稀釋至250ml
（2） 稀鹽酸：V+V=1+5
（3） 磷酸緩沖液（pH＝8）：將60gNa2HPO4·7H2O和10gKH2PO4溶于蒸餾水中并稀釋至200ml。
（4）溴化氫溶液（10%，通風(fēng)櫥中制備）：將370mlH2O溫?zé)嶂?0℃，并加入40gCNBr。振蕩至溶解冷卻并稀釋至400ml。溶液在冰箱保存。
*CNBr劇毒，切勿與皮膚接觸，必須在通風(fēng)櫥中操作。
（5）10%對氨基苯磺酸溶液：按每次1ml將NH4OH加到20g對氨基苯磺酸和170ml蒸餾水的混合液中，直至酸溶解為止。用鹽酸與蒸餾水溶液（1：1）調(diào)節(jié)pH至4.5，采用溴甲酚綠指示劑指示。稀釋至200ml。
*注：因?yàn)槿芤河蓄伾珪绊懽詈蠼Y(jié)果，所以稀釋結(jié)束后溶液應(yīng)幾乎無色
（6）55%對氯基苯磺酸溶液：在55g對氨基苯磺酸中加入27ml蒸餾水和27mlNH4OH，振搖至溶解。（必要時加溫）。用NH4OH或5NHCl調(diào)pH為7，再用蒸餾水稀釋至100ml。（保存在暗處）
5.操作步驟
5.1樣品制備
（1）藥物：將藥品研碎，溶于蒸餾水中，稀釋定容。取10mL樣品于錐形瓶中，加入10mLHCl，在電熱板上加熱蒸發(fā)至約2mL，冷卻，加入25-50mL蒸餾水，用40%NaOH或KOH溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5-4.5。過濾，棄去10mL處液，轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容，使溶液含尼克酸約4μg/mL。
*注：溶液的尼克酸含量應(yīng)在50-200μg/mL
（2）非谷類食品及飼料：稱取約28g樣品，加入0.5mol/LH2SO4200mL，混勻，在高壓釜中121℃加熱半個小時。冷卻，用10mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5，以溴甲酚綠作外指示劑，用蒸餾水稀釋至250mL，過濾。取17g（NH4）2SO4于50mL容量瓶中，吸取40mL樣品液，用H2O稀釋定容，強(qiáng)力振搖。過濾，混勻，取1mL作比色測定用。如果樣品中尼克酸含量為16mg/1b。最終液濃度3.2μg/mL。
移取40mL標(biāo)準(zhǔn)工作液Π至盛有17g （NH4）2SO4的50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，此液含尼克酸3.2μg/mL。
*注：加入H2SO4主要是為了去除樣品中的蛋白及其它雜質(zhì)，以防其對測量結(jié)果造成影響
（3）谷類產(chǎn)品：隨同樣品做1試劑空白和5個濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)液。
分別將1.5gCa（OH）2放入7個錐形瓶中，移入0、5、10、15、20、25mL標(biāo)準(zhǔn)中間液Ι和2.5g樣品（含100μg煙酸），加入蒸餾水至90mL，振搖混勻。高壓121℃下2小時。趁熱混勻，冷卻至40℃，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，稀釋定容。
從容量瓶移50mL上清液至離心管中，冰浴15min或置于冰箱中≥2小時。離心15min，吸取20mL上清液至盛有8g（NH4）2SO4和2mL磷酸鹽緩沖液的離心管中。振蕩溶解并溫?zé)嶂?5-60℃。離心5min，過濾。
5.2操作程序
（1）藥物制劑和非谷類食物和飼料：假如10%的對氨基苯磺酸溶液，CNBr溶液，在通風(fēng)櫥中用酸式滴定管滴入，用標(biāo)準(zhǔn)工作液Π，如下表制備各管：

試劑標(biāo)準(zhǔn)空白 樣品空白
標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL） 1.0 1.0
H2O（mL） 5.0 5.0
稀NH4OH（mL） 0.5 0.5
10%對氨基苯磺酸 2.0 2.0
稀HCl（mL） 0.5 0.5
樣品溶液
標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL） 1.0 1.0
稀NH4OH（mL） 0.5 0.5
CNBr（mL） 5.0 5.0
10%對氨基苯磺酸（mL） 2.0 2.0
H2O（mL） 0.5 0.5

*注：CNBr有毒，注意通風(fēng)
每只樣品都要分別制備樣品空白。
將標(biāo)準(zhǔn)和樣品移入試管中，分別加入5mL蒸餾水作為標(biāo)準(zhǔn)空白和樣品空白。轉(zhuǎn)動試管內(nèi)的液體，立即加入稀NH4OH，轉(zhuǎn)動，加對氨基苯磺酸，再次旋轉(zhuǎn)混合。立即加入0.5mL稀HCl，混勻，置于光電比色計(jì)上，加入對氨基苯磺酸后約30s內(nèi)在430和450nm波長之間任意波長調(diào)節(jié)儀器至0的A值。從加入稀NH4OH開始按標(biāo)準(zhǔn)空白同樣的方法處理標(biāo)準(zhǔn)溶液。立即轉(zhuǎn)動管子，加CNBr溶液并再次轉(zhuǎn)動混勻，在加入CNBr溶液后30s后轉(zhuǎn)動管子，加入對氨基苯磺酸溶液，再轉(zhuǎn)動。立即加入0.5mL蒸餾水，混勻，加塞。，測量。（加入對氨基苯磺酸溶液后1.5min時顏色最深，保留2min，然后慢慢褪色。）
將樣品空白設(shè)在0A，測樣品溶液的A值。若標(biāo)準(zhǔn)和樣品液含量大致相等，則尼克酸含量與A值成正比。
（2）谷類制品：取5只試管，其中兩只加入5mL標(biāo)準(zhǔn)液，兩只加入5mL樣品液，另一只加入5mL蒸餾水做試劑空白。于一只空白管，一只標(biāo)準(zhǔn)管和一只樣品管各加10mL蒸餾水，將所有管置于冰中冰浴30min。對剩下的管按順序加入10mL冷的CNBr，30s后加入1.0mL55%對氨基苯磺酸溶液。
用標(biāo)準(zhǔn)空白在470nm處，調(diào)比色計(jì)為0A，加入對氨基苯磺酸后12-15min讀出其它各管的A值。
*放入比色計(jì)前，試管必需冷卻一致，每管必需拭干。如管呈霧狀，浸于熱水中片刻，測定前拭干。
6.計(jì)算
將扣除試劑空白的標(biāo)準(zhǔn)A對尼克酸含量μg/ml作圖，畫出適宜的直線，從此圖上求出已扣除樣品空白和試劑空白后樣品校正的A所對應(yīng)的濃度C。
Mg尼克酸/g樣品=C/10ng樣品
7. 注意事項(xiàng)
（1） CNBr溶液有毒，要注意安全。
（2） 樣品不同，處理方法不同，不要混淆。
（3） 注意通風(fēng)櫥的通風(fēng)。
（4） 因?yàn)椴捎帽壬y量，因此樣品含有色素易干擾測定，影響測定結(jié)果的正確性。
（5）試管應(yīng)先用洗衣粉清洗后，用水沖凈，再放入酸缸中浸泡1天左右，撈出后再用自來水和蒸餾水清洗干凈，涼干，方可再用。

三、復(fù)合維生素制劑中的煙酰胺測定----分光光度法
1.原理
在PH約4.5處將煙酰胺抽提到KH2PO4溶液中，再與CNBr和巴比士酸反應(yīng)。用分光光度法測定反應(yīng)產(chǎn)物。煙酸含量超過煙酰胺三倍量時干擾煙酰胺測定。
2.適用范圍
選自AOAC；適用于復(fù)合維生素制劑檢測
3.儀器
（1） 攪拌器
（2） 量筒
（3） 錐形瓶
（4） 高壓釜（121℃，15min）
分光光度計(jì)（550nm）
4.試劑
所用試劑皆為分析純；所用水皆為蒸餾水
4.1.煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液：
（1） 標(biāo)準(zhǔn)儲備液（250μg/mL）：50mgUSP煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)加60%乙醇溶解并稀釋到200mL。在10℃貯存。
（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液（5μg/mL）：將少量貯備液溫?zé)嶂潦覝亍Ｈ〕?mL用0.3%KH2PO4溶液稀釋至100mL。

4.2其它試劑
（1）溴化氰溶液：10%，將370mlH2O溫?zé)嶂?0℃，并加入40gCNBr。振蕩至溶解冷卻并稀釋至400ml。溶液在冰箱保存。使用前需恢復(fù)到室溫。
*注：CNBr劇毒，切勿與皮膚接觸，注意在通風(fēng)櫥 中操作。
（2） 磷酸二氫鉀溶液：
A. 13%的磷酸二氫鉀溶液：將30gKH2PO4用蒸餾水溶解并稀釋到1L。
B. 3%的磷酸二氫鉀溶液：將3%的磷酸二氫鉀溶液用蒸餾水稀釋（1+9）。
（3）巴比土酸緩沖液：按每批測定需用量計(jì)算，按每100mL3%KH2PO4溶液加2g試劑級巴比土酸制備。攪拌1小時，用前過濾。
5.操作步驟
5.1樣品制備：取適量樣品于錐形瓶中，加入0.3%的KH2PO4（KH2PO4的量至少是估計(jì)的煙酰胺量的兩倍）。若樣品不易溶解，則振搖使其分散并用高壓釜在121℃下加熱15min。用0.3%KH2PO4溶液稀釋至5μg/mL。過濾。
用蒸餾水代替CNBr分別制備各樣品的空白。
將1mL工作標(biāo)準(zhǔn)液或測定液置于分光光度計(jì)比色管中。加0.5mLCNBr溶液，混勻，塞住，放置25-30min，加10mL巴比土酸溶液并旋搖
*注：若30min后不能加巴比土酸溶液。將管置于碎冰浴中穩(wěn)定CNBr反應(yīng)。
5.2用蒸餾水代替CNBr做為適當(dāng)?shù)目瞻?，?50nm，分光光度計(jì)設(shè)定在0A）顏色最深時測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度
*注：加入巴比土酸后2-4min時顏色最深，穩(wěn)定約1min，慢慢褪去
*注：測定樣品時，其放置時間不應(yīng)超過30min。加入CNBr時應(yīng)有規(guī)律的間隔1-2min。
6.計(jì)算
樣品中煙酰胺含量（mg）=（A×5×稀釋倍數(shù)）/（A'×1000）
式中
A- 樣品吸光度
A'--標(biāo)準(zhǔn)吸光度
5-μg煙酰胺/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液
（結(jié)果用煙酰胺mg/片報(bào)告）
7.注意事項(xiàng)
（1） CNBr有毒，應(yīng)在通風(fēng)櫥中操作。
（2） 樣品中煙酸含量超過煙酰胺含量的三倍量時會干擾煙酰胺的測定，因此樣品應(yīng)有明確的煙酸和煙酰胺的含量。
（3）試管應(yīng)先用洗衣粉清洗后，用水沖凈，再放入酸缸中浸泡1天左右，撈出后再用自來水和蒸餾水清洗干凈，涼干，方可再用。